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作者：闵
在论坛与病友群的交流中，很多病友看到其他病友的基因检测是外送给基因检测公司，拿回来的检测报告厚厚一沓，而自家的检测则是医院自己做的，最终结果就一两页纸，因此会担心是不是自己的检测不专业不全面，纠结需不需要自己联系基因检测公司重新做。
今天就聊一聊医院院内基因检测与外送基因检测公司做基因检测到底有什么区别。 01 检测技术对比
PCR技术与NGS技术是目前临床最常用的两种基因检测技术，两者都可以一次性检测包括点突变、插入以及融合等多种突变类型，且一次实验都可以同时检测如EGFR/ALK/ROS1等多个基因，能够较好的满足临床检测需求，但这两种技术之间也存在很多区别。
PCR技术： 全称聚合酶链式反应，其发明者因此在1993年获得诺贝尔化学奖，是20世纪非常重要的一项生物技术发明。PCR技术在病友口中往往被误传为“一代测序”或者“一代技术”，其实这是错误的，PCR和测序并不是一回事。
PCR的原理是利用一对特异性的引物针对性将待检测的目标基因序列上的特定区域复制重复，若该基因携带有想检测的突变类型，则将被扩增复制，结果就是阳性；若无想检测的突变，则不会扩增，结果就是阴性。
PCR技术通过不同的引物设计达到检测不同基因的目的。
NGS技术： 即Next-generation sequencing（下一代测序），同时也被叫做高通量测序，它才是相较于一代测序（Sanger测序）的第二代技术，也正是因此而被称为二代测序。
NGS在一代测序的基础上提升了精度以及检测通量，可以更多更好地进行检测任务。不同厂家的二代测序仪设计略有不同，但实验步骤大体都可以概括为：
1、样本制备； 2、文库构建； 3、测序反应； 4、数据分析。
测序技术最大的特点就是将目标序列从头到尾的ATCG碱基对排列全部检测出来，然后在与数据库内的正确序列对比以检查目标序列是否发生突变。
理论上，无论是缺失、插入、扩增还是融合等突变类型都可检出，相当于挨家挨户查户口。也正是由于这个特点，导致测序技术常常产生很多冗余信息。
两种技术的不同特点影响了医院和基因检测公司的选择偏好。由于PCR技术操作简便，检测周期短，检测设备价格较便宜，能满足临床需求，较为适合在医院病理科或检验科开展，只需按规范建立PCR实验室即可；而NGS技术操作较复杂，检测周期较长，检测设备与开机成本相对较高，不利于在所有医院推广开展，主要为第三方基因检测公司使用。
然而随着学科发展，少数实力较强的医院也会在院内建立NGS检测平台。而基因检测公司虽以NGS技术为主，也仍然会用PCR技术辅助满足不同检测需求。
02 覆盖基因对比
PCR技术的使用较为灵活，根据使用的检测试剂盒设计不同，可单独检测EGFR等驱动基因，也可做EGFR/ALK/ROS1三联检，还有多基因检测试剂盒组合可以检测EGFR/ALK/ROS1/HER2/MET/KRAS/BRAF/RET等。然而总体上来说，PCR技术一次实验内可以检测的基因数量有限且主要检测突变类型为点突变、插入、融合，不太适合扩增检测；
NGS技术最显著的优势就是高通量，一次可检测几十乃至上百个基因，并且可检测的突变类型多样，包括点突变、插入、融合以及扩增。
显而易见，覆盖基因数量多少是PCR与NGS最直接的区别，也是让很多病友产生动摇与焦虑的根源。
很多病友看见别人做的检测套餐中动辄几十、几百个基因，而自己只有寥寥几个，就难免产生困惑，怀疑自己是不是做得少了，有没有遗漏重要信息。
这其实是陷入了一个心理陷阱，一味的追究所谓“多”和“全”，却没有真正的了解自身病情究竟需要做哪些以及为什么只需要做这些。基因检测不是单纯比较基因数目多少，而是先要了解自己的病种有哪些基因是需要的，把需要检测的、该检测的都检测了，那就不存在所谓“遗漏”。
根据NCCN及我国专家共识，常见实体瘤癌种如非小细胞肺癌、乳腺癌等较为明确的已有对应靶向药物获批上市的基因列表如下：
可以看到实际获批有靶向药的驱动基因（靶向基因）并不多，甚至某些癌种之间还存在交叉，比如BRAF基因突变在非小细胞肺癌、黑色素瘤及结直肠癌中都可能出现。
换句话说，对于病人自身用药指导来说，并不是很需要做几十个甚至上百个基因的大套餐，真正能对治疗用药起关键指导作用的靶向基因只有这么几个。所谓“全基因”套餐中有一大半都没什么实际用处，做得多≠做的有用。
然而NGS技术高通量的优势并非摆设：
第一，靶向基因突变的类型包括点突变、插入、融合以及扩增，通常PCR对于扩增突变的检测不是很方便，因此PCR较难检测到诸如MET、HER2等扩增突变，而NGS可以检测到；
第二，NGS检测的是基因全长序列，并非局限于特定热点区域，因此对于一些靶向基因的罕见突变类型也能够覆盖，例如KIF5B-ALK也属于ALK基因融合的一种，但因发现较晚且突变率较低被认为属于ALK少见融合类型，此类病人可通过NGS技术检测到，但PCR技术则会漏检；
第三，PCR可用于检测常见基因的常规突变类型，但一般不能提示具体突变位点，大多数情况下不影响药物选择，但特殊情况如PCR技术检测到KRAS G12C/G12D突变时就不能区分到底是G12C还是G12D，可只有G12C突变可以使用AMG510治疗，此时PCR技术就稍显无力。相对的，NGS技术则可以提示具体突变位点，更加精准的指导用药。
简单来说，即使对于常见的几个基因，NGS检测也是更加全面具体，不会遗漏，可以作为PCR技术的补充。当PCR检测阴性时，有条件的病友可考虑选择NGS技术再对靶向基因重新检测。
注：常规基因的罕见突变类型≠非常规基因，比如非小细胞肺癌中KIF5B-ALK仍属于ALK融合突变，EGFR C797S突变仍属于EGFR基因，仍然没有超出非小细胞肺癌9大常规驱动基因的范围。
03 检测准确性
2018年Igor Letovanec等[1]对比了PCR与NGS对于非小细胞肺癌ALK融合突变的检测正确率。
结果发现95例样本中NGS成功检测77例（包括阴性和阳性两种结果），检测成功率为81.1%，而96例样本中PCR检测同样检测成功77例，检测成功率为80.2%，两者间相差不大；PCR与NGS两者灵敏度对比为70.0%（总共20个确定阳性样本检出14个） vs 85.0%（总共20个确定阳性样本检出17个，包括NGS检测到的一个ALK罕见融合类型）；PCR与NGS两者特异性对比为87.1%（总共62例确定阴性样本检出54例） vs 79%（总共62例确定阴性样本检出49例）。
整体技术参数对比发现PCR技术与NGS检测性能差异并不是很大。PCR准确性略低于NGS，但特异性更好，即PCR有可能会漏掉一些罕见融合类型，但不容易出现将无突变误检为阳性的情况。
2020年国内一篇研究报道了1046例肺癌病人分别使用PCR技术及NGS技术检测的对比[2]，1046例病人中共有772例组织样本，274例血液标本，主要以EGFR基因突变的检出率为对比标准。
组织样本中，329例使用NGS技术，443例使用PCR技术检测，结果表明NGS技术的EGFR突变检出率为45.9%（151/329），PCR技术的EGFR突变检出率为47.86%（212/443），两者无显著差异。其中PCR技术对于EGFR L858R的检出率显著高于NGS。
血液样本中，83例使用NGS技术，191例使用PCR检测，结果表明NGS技术的EGFR突变检出率为25.3%（151/329），PCR技术的EGFR突变检出率为24.08%（212/443），两者无显著差异，包括两者EGFR L858R检出率也无差异。
很多病友认为医院使用的PCR技术是上个世纪的技术，觉得PCR不如NGS检测的准确，因此对于院内PCR检测的结果产生不信任，总是怀疑检测出错。
然而通过以上两篇研究的结果，可以看到PCR与NGS对于常规基因的常规突变的准确性及特异性差异并不大，NGS对于部分非常规的罕见突变类型有优势，各位不用对院内PCR检测太没信心。
04 总结
虽然大多数医院使用的是PCR技术，但已有少数实力强的医院自行开展NGS技术，二代测序也不再是检测公司的专属，各位不用纠结院内还是院外这种形式上，试着去了解双方实际采用的检测技术更加重要。
就检测性能而言，PCR与NGS在准确性、灵敏度、特异性上差异并不明显。 PCR 具有周期短、检测方便的优势，其所能覆盖的基因数及突变类型也基本能够满足常规指导用药使用，适合病情特别危急需要尽快拿到结果的人群；
而NGS的优势在于高通量，主要体现为覆盖常规基因的各种突变类型以及罕见突变位点，但检测周期长，且常规靶向套餐的检测费用相比PCR技术也略高一些，若病情不是非常紧急或经济不是特别困难的人群，则推荐考虑NGS。
还有些病友觉得院内检测的报告只有一两张纸，太寒酸，不如院外检测的一本书显得专业。这也是一个有失偏颇的心理陷阱，直观的认为花了大价钱就应该多换回点东西。正常情况下，对于病友最有用的就是那一页基因突变的结果，明确有无靶向基因突变，报告再厚也不能从无到有。
归根结底，院内与院外基因检测的差异主要体现在PCR与NGS技术上，各位已经在院内做检测的病友不用过于纠结是否差于院外检测，重要的是明确使用的是何种检测技术，是否覆盖自身癌种所需基因位点，个别院内PCR检测阴性的病友可酌情考虑是否送检院外NGS作为补充，确认是否存在驱动基因的罕见突变。
参考文献 [1]Letovanec I, Finn S, Zygoura P, et al. Evaluation of NGS and RT-PCR methods for ALK rearrangement in European NSCLC patients: results from the European Thoracic Oncology Platform Lungscape Project[J]. Journal of Thoracic Oncology, 2018, 13(3): 413-425. [2]朱丽蒙, 马楠, 任晓妮, 等. 基于 1046 例肺癌靶向基因检测的 ARMS-PCR 和 NGS 技术优势分析[J]. 河南医学研究, 2020.
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