【翻译】联合RAS(ON) G12Cselective抑制剂、SHP2抑制剂使肺肿瘤免疫检查点阻滞敏感
本帖最后由 行走的艺术细菌 于 2025-4-16 01:20 编辑原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-52324-3
以下翻译由AI提供（翻译错误请读者自行甄别）
摘要针对KRAS的非活性，GDP结合形式的突变选择性药物G12C已被批准用于肺癌，但耐药性发展迅速。在这里，我们使用靶向RAS的抑制剂 (RMC-4998)G12C以其活性的GTP结合形式，在各种免疫活性小鼠模型中治疗KRAS突变型肺癌。使用与SHP2抑制剂的联合治疗可以延迟RMC-4998治疗后的RAS途径再激活，这不仅影响肿瘤细胞RAS信号传导，而且还将肿瘤微环境重塑为较少的免疫抑制。在免疫发炎模型中，RAS和SHP2抑制剂的组合通过抑制肿瘤复发和诱导免疫记忆的发展来驱动持久的反应。在免疫排除模型中，组合的RAS和SHP2抑制使肿瘤对免疫检查点阻断敏感，导致有效的肿瘤免疫排斥。这些临床前结果证明了RAS(ON) G12C-selective抑制剂与SHP2抑制剂的组合使肿瘤对免疫检查点阻断敏感的潜力。导言KRAS致癌突变在肺癌中非常常见，是全球癌症相关死亡的主要原因1,2。KRAS蛋白充当信号枢纽，其中上游受体酪氨酸激酶 (RTK) 激活使鸟嘌呤交换因子 (GEF) 成为可能促进KRAS从GDP约束的非活动状态转变为GTP约束的活动状态3。在第12位密码子 (G12C) 的甘氨酸到半胱氨酸的取代是肺癌中最普遍的KRAS致癌突变4。与其他密码子12突变相比，G12C突变不会主要损害KRAS的内在gtp酶水解活性，但会导致KRASG12C对典型的GTPase激活蛋白 (GAP) 不敏感，从而驱动循环KRASG12C主要以其活性GTP结合形式存在5。KRASG12C已经开发出突变特异性抑制剂，例如adagrasib (MRTX849) 和sotorasib (AMG 510)，它们与GDP结合的KRAS的突变半胱氨酸残基共价结合。G12C并阻止它处于非活动状态，防止它循环回活动的GTP绑定状态6,7。KRAS的有希望的初步临床反应G12C抑制剂adagrasib和sotorasib导致其批准用于高级KRAS的临床使用G12C突变的非小细胞肺癌 (NSCLC)。然而，肿瘤很快对这些药物产生耐药性，中位无进展生存期低于7个月。8,9,10。已经提出了几种获得性和适应性抵抗的机制，这些机制强调了开发联合疗法以增强KRAS作用的必要性。G12C抑制剂11,12。许多临床前研究表明，KRASG12C抑制导致上游rtk的反馈再活化，这可导致野生型和突变型RAS同种型的活化。因此，抑制介导从RTK到RAS的上游信号传导的SHP2是克服RTK介导的适应性抗性的另一种机制。13,14,15,16,17,18,19。突变KRAS以其活性形式的表达升高也被认为是对KRAS的抗性机制。G12C(OFF) 抑制剂，因此可以通过使用RAS(ON) G12C-selective抑制剂来克服20。最近，RASG12C已经开发出抑制剂，可作为非降解分子胶与亲环蛋白A (CYPA) 和GTP结合的活性形式的KRAS形成无活性的三复合物。G12C。这些被称为RAS(ON) G12C-selective抑制剂，并且包括RMC-4998，其是代表研究药物RMC-6291的临床前工具化合物。这些代理与KRAS的活动状态的结合可以解决非活动状态选择性KRAS的一些限制G12C(关闭) 抑制剂21。RMC-6291目前正在进行临床评估22虽然等待反应结果的持续时间，但根据迄今为止靶向癌症治疗的经验，肿瘤最终可能也会产生耐药性，这意味着需要联合策略。突变体特异性KRAS的特异性G12C在正常细胞中不抑制野生型KRAS的情况下，癌细胞中突变KRAS的抑制剂有助于确定致癌KRAS信号传导在调节抗肿瘤免疫应答中的作用。这包括抑制干扰素 (IFN) 信号传导，细胞因子表达和随后招募免疫抑制性髓细胞群和抑制适应性T细胞介导的抗肿瘤免疫反应23,24。大量研究表明，KRAS抑制可逆转免疫抑制，导致肿瘤免疫微环境 (TME) 的深刻重塑并激活抗肿瘤免疫，这为与免疫疗法结合提供了机会之窗24,25,26。与靶向治疗相比，免疫治疗导致一小部分患者的长期反应27。此外，anti-PD-1/anti-PD-L1疗法是晚期非小细胞肺癌的一线治疗28,29。在此基础上，一些临床试验正在探索KRAS的组合G12C具有anti-PD-1/anti-PD-L1免疫检查点阻断 (ICB) 的抑制剂。然而，使用临床前模型，我们最近证明了这种组合仅在免疫原性肿瘤中有益，其特征是高淋巴细胞浸润和对anti-PD-1的一些基线敏感性。虽然在缺乏淋巴细胞浸润和ICB敏感性的免疫逃避性肿瘤中没有观察到组合益处24。因此，可能需要额外的联合治疗，可以重塑TME进一步使用KRAS实现长期反应G12C抑制剂，特别是在患有免疫性冷肿瘤的患者中。这种组合的一种可能的治疗方法可能是SHP2的抑制剂: 这些抑制剂不仅抑制癌细胞内信号的适应性重新布线，从而降低对KRAS的敏感性G12C抑制，但也可以直接影响TME内非癌细胞的信号传导，并增强抗肿瘤免疫反应15,30,31,32,33。在这项工作中，我们结合了活动状态选择性RAS(ON) g12C-selective化合物与SHP2抑制剂RMC-4550和ICB RMC-4998，并研究这些组合在具有不同程度免疫原性的肺癌的临床前模型中的作用。我们证明，即使使用靶向KRAS的化合物，癌细胞中的MAPK再激活也是不可避免的。G12C活性状态，尽管这可以通过添加SHP2抑制剂来抑制和延迟。此外，我们显示RMC-4998和RMC-4550的组合在具有免疫原性肺肿瘤的小鼠中产生长期反应，包括高比例的免疫介导的肿瘤根除。在具有侵袭性免疫排斥肺肿瘤的小鼠中，RMC-4998和RMC-4550的组合重塑TME，激活适应性免疫并使肿瘤对ICB敏感，从而将这些非发炎的肿瘤转化为更发炎的肿瘤，ICB敏感表型。最后，我们提供了表明SHP2抑制剂对TME细胞的直接作用的证据。
结果RAS的组合G12C(ON) 和SHP2抑制抑制MAPK重新激活并促进IFN反应为了研究RAS(ON) G12C-selective三复合物抑制剂RMC-4998的肿瘤细胞内在作用，我们最初使用KRAS进行细胞活力测定G12C-用RMC-4998或KRAS处理的突变NSCLC细胞系G12C(关闭) 抑制剂adagrasib (MRTX849)。人 (CALU1和NCI-H23) 和鼠 (KPARG12C和3LL-ΔNRAS) NSCLC细胞系与任一化合物一起导致细胞活力的浓度依赖性降低，与MRTX849相比，RMC-4998显示出增加的活性 (图。 1a和补充图。1a)。接下来，我们评估了两种化合物对下游信号传导的影响。MAPK活性被RMC-4998迅速消除，在孵育的前15分钟内ERK磷酸化减少，而MRTX849的MAPK抑制仅在较晚的时间点明显 (补充图。1b, c)。因此，RAS(ON) G12C-selective抑制剂比KRAS更迅速地阻断KRAS信号。G12C(OFF) 抑制剂，如预期的那样，因为它直接靶向KRAS的活性形式。然而，在更长的时间点，针对KRAS的活动状态G12CRMC-4998还显示在24-48 °h时ERK磷酸化的恢复，与MRTX849的恢复更为可比，表明MAPK途径的重新激活和适应性机制的发展 (图。 1b)。这些观察结果表明，即使使用针对KRAS活性状态的抑制剂G12C,适应性机制最终将发展，强调组合策略的必要性。图1: SHP2抑制剂RMC-4550防止对RAS(ON) G12C-selective抑制剂RMC-4998的适应性反应。https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41467-024-52324-3/MediaObjects/41467_2024_52324_Fig1_HTML.png
a用连续稀释的RMC-4998或MRTX849处理72小时的人KRAS突变细胞系的活力。数据是两个独立实验的平均值 ± ± sem。b用100 °nmrtx849或100 °nm RMC-4998处理6、24或48 °h的人KRAS突变细胞系的蛋白质印迹。DMSO处理的细胞用作对照 (C)。印迹是两个独立实验的代表。c在不同时间点用1 μ m RMC-4550、100 μ m RMC-4998或组合处理的人KRAS突变细胞系的蛋白质印迹。印迹是三个独立实验的代表。人类的生存能力 (d) 或鼠标 (e) 在存在或不存在1 μ m RMC-4550的情况下，用连续稀释的RMC-4998处理72 °h的KRAS突变细胞系。数据是三个独立实验的平均值 ± ± sem。使用双向ANOVA计算统计学。f膜联蛋白V阳性KPAR的百分比G12C用1 μ m RMC-4550、100 μ nm RMC-4998或组合处理72小时后的细胞。数据是三个独立实验的平均值 ± ± sd。使用单向ANOVA进行分析。gKPAR的结晶紫染色G12C用200 °nmrtx849、200 °nm RMC-4998、1 °m RMC-4550或其组合处理细胞6天。两个独立实验的代表性图像。hKPAR中IFN诱导基因的qPCR分析G12C在100 ng/ml重组ifn γ 存在下，用1 μ m RMC-4550、100 nm RMC-4998或其组合处理细胞24小时。DMSO处理的细胞用作对照。数据是三个独立实验的平均值 ± ± sd。使用单向ANOVA进行分析。仅显示了重要的比较。DMSO条件仅与DMSO rifn γ 进行了比较。对于所有统计分析 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。源数据和精确p值作为源数据文件提供。
全尺寸图像
先前的研究已经证明了SHP2通过传播上游RTK活性升高的下游信号，包括诱导野生型K-的循环，在促进MAPK通路重新激活中的作用，H-和n-ras同工型到GTP结合的激活状态14。出于这个原因，我们结合了RMC-4550，一种SHP2变构抑制剂32,使用RAS(ON) G12C-selective抑制剂RMC-4998评估MAPK再激活是否可以被抑制。实际上，在人NSCLC细胞系中，RMC-4550与RMC-4998的组合减少了ERK磷酸化在较晚时间点 (24-48 °h) 的反弹，并导致细胞活力的更强降低 (图 1c, d)。此外，这种组合导致增强的通路抑制，表现为下游MAPK转录目标的表达降低。Dusp6,降低小鼠细胞系KPAR的细胞活力和增加凋亡G12C(图。 1e, f和补充图。1d)。这些影响扩展到更长的时间点 (6天)，其中KPARG12C每48小时向培养物补充化合物，验证了先前的观察结果，即途径再激活不是由于化合物利用率降低 (图。 1g)。KRAS抑制还可以导致癌细胞中I型和II型IFN反应的激活增加，这对于抗肿瘤免疫反应至关重要24。与此一致，用RMC-4998治疗增强了IFN γ 的转录反应，该反应通过IFN靶基因的表达增加来衡量 (Irf1,Irf7,Irf9,Cd274,B2m,H2-d1) 对体外ifn γ 处理的反应 (图。 1小时和补充图。1e)。有趣的是，使用RMC-4550的SHP2抑制导致了类似的效果，尽管程度较小，这是由于对MAPK途径的抑制效率较低 (图。 1c)，而组合表型RMC-4998 (图。 1小时和补充图。1e)。总之，这些数据表明，在KRASG12C突变肺癌细胞，共同靶向RASG12C(ON) 和SHP2限制了适应性抗性的发展，这导致癌细胞凋亡和肿瘤细胞内在IFN途径反应的增加。RASG12C(ON) 和SHP2抑制在NSCLC的免疫原性模型中驱动免疫依赖性治愈鉴于KRAS在调节抗肿瘤免疫反应中的关键作用，我们确定了RMC-4998和RMC-4550在治疗由KPAR移植形成的肿瘤中的抗肿瘤活性。G12C细胞，非小细胞肺癌的免疫原性小鼠模型26。这些细胞，来自一个KRASLSL-G12D/−Trp53f/flRosa26hA3BiRag1−/−背景，刺激针对抑制的内源性逆转录病毒抗原的内源性抗肿瘤免疫反应，并对免疫疗法有部分反应26。明显的肿瘤缩小和已建立的皮下KPAR的一些持久的完全消退 (CRs，即使在治疗停止后也没有肿瘤复发) 的产生G12C用RMC-4998和RMC-4550观察到免疫活性小鼠的肿瘤 (图。 2a, b)。具体地，仅治疗2周后，RMC-4998施用导致6/8 (75%) CRs的产生，而RMC-4550导致1/7 (14.3%) CRs的产生。重要的是，RMC-4998和RMC-4550的组合在所有接受治疗的小鼠中预防了停药后的肿瘤复发，给予8/8 CRs，证实了该组合的活性增加 (图。 2b)。显示完全肿瘤消退的小鼠然后用KPAR在另一侧再次攻击G12C在没有进一步治疗的情况下皮下注射，以评估针对KPAR的免疫记忆的发展G12C癌细胞。事实上，大多数小鼠拒绝肿瘤再攻击并保持无肿瘤 (补充图。2a)。这些数据表明RMC-4998和RMC-4550都促进了抗肿瘤免疫应答的诱导。因此，我们评估了这些化合物在免疫缺陷的皮下KPAR中的作用。G12C荷瘤Rag1−/−缺乏功能性T和B淋巴细胞并且不能诱导适应性免疫应答的小鼠。RMC-4998和RMC-4550的组合显示出比单独的RMC-4550或RMC-4998更高的活性。然而，没有观察到CRs的产生，所有肿瘤都在治疗停止后重新出现，这表明适应性免疫对于长期CRs的产生是必不可少的 (图。 2c和补充图。2b)。图2: RAS的组合G12C(ON) 在免疫原性皮下KPAR中RMC-4550 SHP2抑制剂的抑制剂RMC-4998G12C肿瘤。https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41467-024-52324-3/MediaObjects/41467_2024_52324_Fig2_HTML.png
aKPAR的肿瘤生长G12C皮下肿瘤每天用30 μ mg/kg RMC-4550和/或100 μ mg/kg RMC-4998治疗2周。车辆 (n = 7)，RMC-4550 (n = 7)，RMC-4998 (n = 8)，RMC-4998 + RMC-4550 (n = 8)。灰色区域表示治疗期。数据为平均肿瘤体积 ± ± sem。使用单向方差分析 (*p < 0.05, ****p < 0.0001)。b在小鼠实验的整个过程中，个体肿瘤体积 (a)。指示完全回归 (CR) 的数量。灰色区域表示治疗期。cKPAR的个体肿瘤生长G12C在Rag1中生长的皮下肿瘤−/−每天用30mg/kg RMC-4550和/或100mg/kg RMC-4998治疗小鼠2周。车辆 (n = 8)，RMC-4550 (n = 8)，RMC-4998 (n = 7)，RMC-4998 + RMC-4550 (n = 8)。肿瘤生长的平均值和统计学显著性显示在补充图中。2b。源数据和精确p值作为源数据文件提供。
全尺寸图像
最近的研究强调了皮下和原位肺肿瘤之间适应性抗肿瘤免疫反应的对比34。因此，我们希望将我们的发现扩展到原位环境，并研究RMC-4998和RMC-4550对原位KPAR的影响。G12C肺肿瘤，已被证明对PD-1阻滞部分敏感26。与皮下肿瘤类似，抑制KRAS的活性形式G12C获得了比SHP2抑制更好的反应。治疗2周结束时的微ct扫描显示，RMC-4998抑制KRAS导致大多数肿瘤100% 消退 (图。 3a)。尽管如此，治疗停止后2周的微ct扫描显示，RMC-4998治疗的肿瘤中约有50% 复发，而RMC-4998和RMC-4550联合治疗的肿瘤中只有约10% 复发，证明了这种组合在抑制早期肿瘤复发方面的重要性 (图。 3b)。KPAR的处理G12CRMC-4998和RMC-4550 2天的肿瘤导致Dusp6这表明MAPK途径受到抑制 (补充图3a)，与我们的体外观察结果一致 (补充图1d)。平行地，升高的表达Cd8a,Pdcd1和Gzma和减少表达Arg1仅治疗2天后，提示CD8浸润和活化+T细胞和M2-like髓样细胞的抑制 (补充图。3a)。KPAR的处理G12CRMC-4998和RMC-4550 4天的肿瘤也显示增殖和活化的CD8数量增加+T细胞 (图。 3c)。基于这些观察结果和适应性免疫对于产生长期反应的重要性，我们决定将RMC-4998和RMC-4550与anti-PD-1 ICB疗法相结合，ICB疗法是NSCLC患者的既定免疫疗法选择。值得注意的是，向RMC-4550或/和RMC-4998中添加anti-PD-1疗法延长了原位KPAR小鼠的生存期。G12C在用RAS(ON) G12C-selective抑制剂治疗的那些组中，肿瘤并导致CRs (图。 3d)，即使治疗期只有2周。RMC-4998与anti-PD-1的组合是CRs的主要驱动因素，而RMC-4550与RMC-4998的组合，即使其延长存活，也仅产生与RMC-4998单一疗法相等数目的完全响应者。测试三重组合和anti-PD-1 RMC-4998之间的差异是否由于KPAR的高灵敏度而导致G12C肿瘤RMC-4998 (图。 3a)，我们产生了一种反应较差的细胞系KPAR.M7，它来自原位肺KPARG12C在MRTX849上生长的肿瘤 (参见 “方法” 部分)。在皮下KPAR.M7肿瘤中，用RMC-4998或RMC-4550治疗仅延迟肿瘤生长 (图。 3e和补充图。3b) 然而，未能生成与我们在父KPAR中观察到的相反的CRsG12C模型 (图。 2b)。尽管RMC-4998使KPAR.M7对anti-PD-1敏感 (图。 3e)，它仍然无法产生任何持久的CRs，而三重组合产生了4/7 (57.1%) 的CRs (图。 3f)。图3: RAS(ON) G12C-selective抑制剂RMC-4998与SHP2抑制剂RMC-4550的组合以及免疫原性KPAR的anti-PD-1G12C肿瘤。https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41467-024-52324-3/MediaObjects/41467_2024_52324_Fig3_HTML.png
a原位KPAR的肿瘤体积变化G12C每天用载体治疗小鼠2周后的肿瘤 (n = 2)，30 mg/kg RMC-4550 (n = 7)，100 mg/kg RMC-4998 (n = 8) 或RMC-4998 + RMC-4550 (n = 8)。每个条代表一个肿瘤。在其他组中施用相同的治疗剂量。b左图: 来自 (的肿瘤百分比a) 经过2周的micro-ct扫描无法检测到的治疗后，与初始体积相比有所消退或增加。右图: 与治疗结束时的肿瘤体积相比，基于停止治疗2周后的体积变化对相同的肿瘤进行分类。缺失的肿瘤对应于在4周扫描之前死亡的小鼠。cTop: CD8的密度+T细胞，Ki-67+和PD-1+使用原位KPAR的8重免疫荧光鉴定CD8 T细胞G12C用载体治疗4天后的肿瘤 (n = 5)，RMC-4550 (n = 5)，RMC-4998 (n = 6)，RMC-4998 + RMC-4550 (n = 4)。数据是中位数，方框从第25个百分位数延伸到第75个百分位数，胡须显示最小值和最大值。每个点是一个单独的肿瘤。使用单向ANOVA进行分析。底部: CD8的代表图像+T细胞。d携带KPAR的小鼠的存活率G12C在存在或不存在anti-PD-1的情况下，每天用RMC-4550和/或RMC-4998治疗原位肺肿瘤2周 (2周内4次剂量)。灰色区域表示治疗期。指示完全响应者 (CR) 的数目。n = 5-8只小鼠/组。使用对数秩Mantel-Cox检验进行分析。e用载体治疗的KPAR.M7皮下肿瘤的肿瘤生长 (n = 7)，RMC-4550 (n = 7)，RMC-4998 (n = 7)，RMC-4998 + anti-PD-1 (n = 6)，RMC-4998 + RMC-4550 (n = 7)，RMC-4998 + RMC-4550 + anti-PD-1 (n = 7)。灰色区域表示治疗期。数据为平均肿瘤体积 ± ± sem。使用双向ANOVA进行分析。f在小鼠实验的整个过程中，个体肿瘤体积 (e)。指示完全回归 (CR) 的数量。补充图中显示了单一治疗和对照。3b。对于所有统计分析 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。源数据和精确p值作为源数据文件提供。
全尺寸图像
总之，这些数据表明，RAS的组合G12C(ON) 和SHP2抑制可以激活适应性免疫反应，抑制肿瘤复发，并与anti-PD-1免疫疗法协同作用，在NSCLC的免疫原性小鼠模型中以高频率产生完全治愈。RASG12C(ON) 和SHP2抑制与ICB协同作用，在皮下免疫排斥的NSCLC anti-PD-1耐药模型中产生治愈接下来，我们利用3LL-ΔNRAS可移植小鼠模型来评估对RMC-4998和RMC-4550的反应以及在免疫排除的anti-PD-1抗性肺癌模型中与免疫疗法组合的潜力。最初，我们评估了anti-PD-1和/或anti-CTLA-4对免疫活性小鼠皮下3LL-ΔNRAS肿瘤的影响。事实上，3LL-ΔNRAS肿瘤对anti-PD-1和/或anti-CTLA-4是完全难治性的，除了anti-CTLA-4组中的一个反应者 (图。 4a和补充图。4a)。用RMC-4998或RMC-4550治疗可对肿瘤生长产生深远的抑制作用，当两种化合物联合使用时，这种抑制作用得到了延长 (图。 4b)。与KPAR中获得的结果相反G12C模型 (图。 2a, b)，使用RMC-4998或RMC-4550产生了类似的反应。此外，用这些靶向疗法治疗并没有导致任何持久的CRs，因为所有小鼠在治疗时都复发了，包括用RMC-4998和RMC-4550一起治疗的小鼠 (图。 4b, c)。值得注意的是，向RMC-4998和RMC-4550的组合中添加anti-PD-1增强了抗肿瘤反应，因为它导致3/8 (37.5%) 小鼠中产生CRs。相比之下，anti-PD-1与单独RMC-4998或RMC-4550的组合仅显示出抗肿瘤反应的边际增强 (补充图。4b)。这些数据强化了之前的观察结果，即KRASG12C单独的抑制不会使免疫排斥的肿瘤对anti-PD-1敏感，并强调了抑制两种KRAS的先决条件G12C和SHP2抑制使3LL-ΔNRAS肿瘤对anti-PD-1免疫疗法敏感24。相比之下，当与anti-CTLA-4联合作为单一药物时，RMC-4998或RMC-4550均显示出增加的抗肿瘤活性并诱导偶尔的CRs (补充图。4b)。然而，添加anti-PD-1并没有太大提高这些双峰的活性 (补充图。4b)。在皮下肿瘤中观察到的anti-CTLA-4的额外益处可能反映了调节性T细胞 (Tregs) 的耗竭或CD28对效应T细胞的阳性共刺激的CTLA-4-mediated抑制作用的减弱。35。有趣的是，anti-CTLA-4与RMC-4998和RMC-4550的组合显示出与anti-PD-1的三重组合相似的效果 (补充图。4d)，而靶向和ICB疗法的四重组合导致几乎所有小鼠的肿瘤根除 (图。 4c, e和补充图。4d)。在没有进一步治疗干预的情况下，用3LL-ΔNRAS皮下注射对产生的完全响应者进行再攻击。重要的是，我们在大多数小鼠中观察到肿瘤排斥反应，这表明在这种免疫逃避癌症模型中有效的免疫记忆的发展 (图。 4d和补充图。4c)。图4: RAS(ON) G12C-selective抑制剂RMC-4998与SHP2抑制剂RMC-4550的组合使3LL-ΔNRAS皮下肿瘤对免疫疗法敏感。https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41467-024-52324-3/MediaObjects/41467_2024_52324_Fig4_HTML.png
a用10 μ mg/kg anti-PD-1、5 μ mg/kg anti-CTLA-4或其组合治疗的3LL-ΔNRAS皮下肿瘤的肿瘤生长。车辆 (n = 6)，anti-CTLA-4 (n = 8)，anti-PD-1 (n = 7)，anti-PD-1 + anti-CTLA-4 (n = 6)。抗体每周施用两次，持续2周。灰色区域表示治疗期。在其他组中施用相同的ICB剂量和治疗方案。数据为平均肿瘤体积 ± ± sem。使用双向ANOVA进行分析。仅显示了重要的比较。b在存在或不存在ICB的情况下，每天用30 °mg/kg RMC-4550和/或100 °mg/kg RMC-4998治疗的3LL-ΔNRAS皮下肿瘤的肿瘤生长。车辆 (n = 7)，RMC-4550 (n = 6)，RMC-4998 (n = 8)，RMC-4998 + RMC-4550 (n = 8)，RMC-4998 + RMC-4550 + anti-PD-1 (n = 8)，RMC-4998 + RMC-4550 + anti-PD-1 + anti-CTLA-4 (n = 8)。灰色区域表示治疗期。数据为平均肿瘤体积 ± ± sem。使用双向ANOVA检验进行分析。c在小鼠实验的整个过程中，个体肿瘤体积 (b)。指示完全回归 (CR) 的数量。d小鼠在 (c) 拒绝原发肿瘤的人在另一侧再次受到攻击，并测量肿瘤体积。指示实现免疫排斥 (IR) 的小鼠的数目。使用相似年龄的幼稚小鼠作为对照。图例表示原发肿瘤接受的治疗。e显示小鼠完全回归 (CR) 百分比的图表 (c) 和补充图。4b,d。fKPB6的肿瘤生长G12C皮下肿瘤每天用30 μ mg/kg RMC-4550和/或100 μ mg/kg RMC-4998在10 μ mg/kg anti-PD-1存在或不存在下治疗3周。车辆 (n = 6)，RMC-4550 (n = 7)，RMC-4998 (n = 7)，RMC-4998 + RMC-4550 (n = 7)，RMC-4998 + RMC-4550 + anti-PD-1 (n = 8)。灰色区域表示治疗期。数据为平均肿瘤体积 ± ± sem。使用双向ANOVA进行分析。对于所有统计分析 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。源数据和精确p值作为源数据文件提供。
全尺寸图像
然后，我们试图分析KRAS的组合是否G12C具有SHP2抑制作用的 (OFF) 抑制剂adagrasib (MRTX849) 也可以使免疫排斥的肿瘤对anti-PD-1敏感。与RAS(ON) G12C-selective抑制剂RMC-4998获得的结果相似，RMC-4550延长了用MRTX849治疗的小鼠的存活率 (补充图。4e)，并在这种组合中增加了anti-PD-1，从而产生了耐用的CRs (补充图。4e)。为了扩展我们的发现，我们使用了皮下KPB6G12C由于克隆单核苷酸变异数量少，对KRAS的组合无反应，发展免疫冷肿瘤的模型G12C抑制和anti-PD-1治疗，即使它们对KRAS高度敏感G12C抑制24,26。与以前观察到的类似，皮下KPB6的RMC-4998治疗G12C肿瘤诱导了显著的肿瘤生长抑制 (图。 4f)。用RMC-4998和RMC-4550治疗没有提供额外的益处，而在RMC-4998和RMC-4550组合中加入anti-PD-1进一步抑制了肿瘤的生长 (图。 4f)，表明这种组合使这种免疫感冒模型对anti-PD-1部分敏感。总之，在皮下设置中，组合RASG12C(ON) 和SHP2抑制使免疫排斥的NSCLC肿瘤对anti-PD-1免疫疗法有反应，进一步添加anti-CTLA-4可根除大多数肿瘤。RASG12C(ON) 和SHP2抑制将免疫排斥的肺癌TME重塑为发炎的表型先前的研究表明，两个KRASG12C(OFF) 和SHP2抑制剂可以重塑免疫TME并部分逆转免疫抑制15,30。因此，我们使用原位3LL-ΔNRAS模型来研究RAS(ON) G12C-selective抑制剂RMC-4998和SHP2抑制剂RMC-4550对肺TME的影响。3LL-ΔNRAS肿瘤的特征在于髓样细胞的显著浸润，其抑制免疫应答并促进肿瘤生长。已建立的3LL-ΔNRAS肺肿瘤的流式细胞术分析证实了这一点，并且与免疫原性KPAR相比，淋巴细胞的浸润较差。G12C主要由淋巴细胞浸润的模型 (补充图。5a)。接下来，我们试图在用RMC-4998和/或RMC-4550治疗8天后对3LL-ΔNRAS肿瘤进行免疫表型分析，重点是髓样细胞。治疗显示骨髓细胞浸润减少，如经典单核细胞 (经典MOs; CD11b+CD11c−Ly6G−Ly6C+) 和中性粒细胞 (嗜中性粒细胞1; CD11b+CD24+Ly6G高Ly6C+无花果。 5a)。在间质巨噬细胞中观察到化合物之间的不同作用 (m Φ s; CD64+MerTK+)，其中RMC-4998增加了浸润，而该种群随着组合而减少 (图。 5a)。RMC-4998治疗也增加了CD86的存在+MHCII+和PD-L1+RMC-4550治疗的肿瘤的间质性m Φ 在这些子集中的比例明显增加 (图 5b)。这些观察结果暗示了对TME的骨髓隔室的一些RMC-4550影响，而与癌细胞固有的MAPK途径无关。间质性m Φ 隔室的进一步表征显示，在RMC-4550治疗组中，MHCII，PD-L1，CD11c和MerTK的表达增加，CD206的表达受到抑制，提示间质m Φ 向成熟和抗原呈递的功能转化，主要由SHP2抑制驱动 (图 5c和补充图。5b)。相反，用RMC-4998或RMC-4550治疗的肿瘤的间质m Φ 降低了ARG1的表达，这表明癌细胞MAPK途径的抑制阻碍了间质m Φ 的免疫抑制特性 (图 5c, d和补充图。5b)。有趣的是，只有RMC-4998和RMC-4550的组合诱导Nos2,表明尽管任何一个KRASG12C或者SHP2抑制可以驱动免疫抑制髓样驱动程序的耗竭，只有联合抑制导致直接抗肿瘤髓样功能的诱导 (图。 5d)。用RMC-4998或RMC-4550治疗的3LL-ΔNRAS肿瘤的RNA测序 (rna-seq) 显示，相对于RMC-4998，RMC-4550治疗的肿瘤中骨髓介导的过程下调 (补充图。5c)，这与图中所示的渗透差异一致。 5a。同样，与单独RMC-4998相比，在7天后，用RMC-4998和RMC-4550联合治疗的肿瘤中编码已知骨髓标志物的基因被耗尽 (补充图。5d)。与之前的报道一样，SHP2抑制可以直接改变骨髓功能，这些数据证明了RMC-4550对骨髓群的其他癌细胞外在特性。30,36。此外，我们在用RMC-4998和RMC-4550联合治疗的肿瘤中观察到H-2K的表达增加。bI型常规树突状细胞 (cDC1s)，表明联合治疗可能增加交叉呈递 (图。 5e)。图5: RAS(ON) G12C-selective抑制剂RMC-4998和SHP2抑制剂RMC-4550改变3LL-ΔNRAS肺肿瘤的TME中的骨髓细胞景观。https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41467-024-52324-3/MediaObjects/41467_2024_52324_Fig5_HTML.png
a用载体治疗8天后，通过多参数光谱流式细胞术鉴定的3LL-ΔNRAS肺肿瘤中嗜中性粒细胞，经典单核细胞和间质巨噬细胞的频率 (n = 8)，100 mg/kg RMC-4998 (n = 10)，30 mg/kg RMC-4550 (n = 10) 或组合 (n = 9)。除非另有说明，否则在其他小组中使用相同的治疗、剂量和时间表。数据为平均值 ± SD。每个点代表一个独立的生物小鼠，其中分离的肿瘤汇集在一起。使用单向ANOVA检验进行分析。仅显示了重要的比较 (其余面板也同样如此)。bCD86的频率+MHCII+(左面板) 和PD-L1+(右图) 用载体治疗的3LL-ΔNRAS肺肿瘤中的肿瘤浸润间质巨噬细胞 (n = 8)，RMC-4998 (n = 10)，RMC-4550 (n = 10) 或组合 (n = 9)。数据为平均值 ± SD。每个点代表一个独立的生物小鼠，其中分离的肿瘤汇集在一起。使用单向ANOVA检验进行分析。c显示平均荧光强度 (MFI) 的热图，显示在补充图中。5b,z-在治疗的3LL-ΔNRAS肺肿瘤中肿瘤浸润性间质巨噬细胞的MHCII，PD-L1，CD11c，MerTK，CD206和ARG1的评分。车辆 (n = 8)，RMC-4998 (n = 10)，RMC-4550 (n = 10) 或组合 (n = 9)。dqPCR分析Arg1和Nos2用RMC-4998和/或RMC-4550治疗7天的3LL-ΔNRAS肺肿瘤。数据为平均值 ± SD；n = 4只小鼠/组。每个点代表一个肿瘤，2个肿瘤/小鼠。使用单向ANOVA检验进行分析。eH-2K平均荧光强度b经治疗的3LL-ΔNRAS肿瘤中的肿瘤浸润性cdc1。数据为平均值 ± SD。每个点代表一个独立的生物小鼠，其中分离的肿瘤汇集在一起。车辆 (n = 8)，RMC-4998 (n = 10)，RMC-4550 (n = 10) 或组合 (n = 9)。使用单向ANOVA检验进行分析。f光谱流式细胞术免疫表型分型，如补充信息所示 1(补充图。9)，用载体治疗8天的3LL-ΔNRAS肺肿瘤 (n = 8)，RMC-4998 (n = 10)，RMC-4550 (n = 10) 或组合 (n = 9)。对于所有统计分析 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。源数据和精确p值作为源数据文件提供。
全尺寸图像
除了所描述的骨髓种群变化外，用RMC-4998或RMC-4550治疗的3LL-ΔNRAS肿瘤的免疫表型也显示出整体淋巴细胞区室的增加，这种组合加剧了这种作用 (图 5f)。因此，我们接下来研究了RMC-4998和RMC-4550治疗对淋巴细胞的影响，考虑到致癌KRAS在抑制IFN途径，防止随后的抗原呈递和T细胞活化中的作用，以及SHP2在调节淋巴细胞功能中的关键作用37,38。类似于以前用KRAS观察到的G12C(OFF) 抑制剂，抑制RASG12C(上) 导致肿瘤浸润性CD8增加+T和Treg细胞 (图。 6a, b和补充图。6a)。与RMC-4998治疗的肿瘤相比，RMC-4550-treated肿瘤的特征是T细胞的存在进一步升高，这也反映在联合靶向治疗的肿瘤中。再次指出SHP2抑制对TME的额外影响，与对癌细胞信号的任何影响无关 (图。 6a, b)。所有治疗均导致CD8的激活增加。+和CD4+T细胞和向效应记忆表型的转变 (图。 6c和补充图。6b)。此外，用RMC-4998和RMC-4550治疗的肿瘤中的肿瘤浸润T细胞显示出明显的活化，增殖和潜在的抗肿瘤细胞毒性分子的表达，例如tnf α，ifn γ 和颗粒酶B (图。 6d和补充图。6c-e)。与这些数据一致，用RMC-4550或RMC-4998治疗的肿瘤的基因集富集分析揭示了IFN反应的激活 (补充图。6f, g)，而双重靶向疗法治疗的肿瘤显示出干扰素和炎症相关途径的富集，与两种单一疗法相比 (图。 6e)。同样，肿瘤浸润性NK (CD49b+Nkp46+) 对双重RMC-4998和RMC-4550治疗反应显示增殖增加的细胞，即使在NK细胞数量方面未观察到RMC-4998和/或RMC-4550治疗的肿瘤之间的差异，表明潜在的活动增加 (图。 6f)。与该数据一致，用RMC-4998和RMC-4550治疗的肿瘤中的肿瘤浸润NK细胞显示出抗肿瘤细胞毒性分子粒酶B的表达升高 (补充图6h)。有趣的是，肿瘤浸润b细胞 (B220+CD19+) 在RMC-4550治疗的肿瘤中独特地增加，同时肿瘤浸润性浆细胞 (CD138+) (图。 6g)，表明SHP2抑制在b细胞群中具有额外的作用。图6: RAS(ON) G12C-selective抑制剂RMC-4998和SHP2抑制剂RMC-4550在3LL-ΔNRAS肺肿瘤的TME中诱导泛淋巴细胞抗肿瘤应答。https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41467-024-52324-3/MediaObjects/41467_2024_52324_Fig6_HTML.png
CD8的频率+,CD4+效应器T (a) 和Treg细胞 (b) 和PD-1+CD8+,CD4+效应T细胞 (c) 在用100 μ mg/kg RMC-4998，30 μ mg/kg RMC-4550或组合治疗7天的3LL-ΔNRAS原位肺肿瘤中。两个独立实验的数据 ± SEM。每个点代表一个独立的生物小鼠，其中分离的肿瘤汇集在一起。使用单向ANOVA检验进行分析。dPD-1频率+,Ki-67+,TNF-α+IFN-γ+、GzmB+CD8+用100 μ mg/kg RMC-4998和30 μ mg/kg RMC-4550的组合处理3LL-ΔNRAS肺肿瘤中的T细胞7天。数据为平均值 ± SD。每个点代表一个独立的生物小鼠，其中分离的肿瘤汇集在一起。分析是使用双尾学生的t-测试。e显著 (fdr < 0.05) 的总结与RMC-4998或RMC-4550治疗的肿瘤相比，用组合的100 °mg/kg RMC-4998和30 °mg/kg RMC-4550治疗的肿瘤中的途径下调或上调 (MSigDB标志)。fNK和Ki-67的频率+用100 μ mg/kg RMC-4998、30 μ mg/kg RMC-4550或其组合处理7天的3LL-ΔNRAS肺肿瘤中的NK细胞。每个点代表一个独立的生物小鼠，其中分离的肿瘤汇集在一起。NK细胞频率的两个独立实验的数据 ± SEM。Ki-67数据 ± SD+NK细胞频率。使用单向ANOVA检验进行分析。g用100 μ mg/kg RMC-4998，30 μ mg/kg RMC-4550或其组合治疗7天的3LL-ΔNRAS肺肿瘤中B，浆细胞的频率。每个点代表一个独立的生物小鼠，其中分离的肿瘤汇集在一起。B细胞频率的两个独立实验的数据 ± SEM。等离子单元频率的数据 ± SD。使用单向ANOVA检验进行分析。对于所有统计分析 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。仅显示了重要的组合。源数据和精确p值作为源数据文件提供。
全尺寸图像
总之，这些结果强调了将RAS(ON) G12C-selective抑制剂 (例如RMC-4998) 与第二靶向化合物 (例如SHP2抑制剂RMC-4550) 组合的机制原理。除了增强肿瘤细胞的内在反应外，还可以直接靶向TME并增强免疫反应。用这些化合物的组合治疗导致免疫TME的显著改变，并导致先天性和适应性抗肿瘤免疫应答的平行激活。RASG12C(ON) 和SHP2抑制与ICB在NSCLC原位免疫排斥anti-PD-1耐药模型中的协同作用如上所述，组织部位是确定抗肿瘤反应的重要因素。因此，我们接下来研究了RMC-4998和/或RMC-4550与ICB疗法组合对原位肺环境中的ICB抗性3ll-Δnras模型的治疗影响。最初，我们证实3ll-Δnras肺肿瘤对anti-PD-1，anti-CTLA-4或两者联合治疗均无效 (补充图7a)。接下来，我们确定了治疗7天后RMC-4998和RMC-4550对肿瘤生长的影响。用SHP2抑制剂治疗RMC-4550导致肿瘤生长减慢，但大多数肿瘤仍在进展。相比之下，超过一半的用RAS(ON) G12C-selective抑制剂治疗的肿瘤RMC-4998消退 (图。 7a)。RMC-4998和RMC-4550单一疗法都将生存期延长到相当的水平，这是令人惊讶的，因为在治疗7天后RMC-4550缺乏明显的消退 (图。 7a, b)。RMC-4550对存活的长期影响可能反映了前面描述的非肿瘤细胞内在作用，其导致抗肿瘤反应的激活和肿瘤生长的延迟。与皮下数据一致，RMC-4998和RMC-4550的结合增强了肿瘤反应，几乎所有分析的肿瘤都有深刻的回归，并延长了生存期 (图。 7a, b)。图7: 在NSCLC的原位免疫排除的anti-PD-1抗性模型中，RAS(ON) G12C-selective抑制剂RMC-4998和SHP2抑制剂RMC-4550与ICB协同作用。https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41467-024-52324-3/MediaObjects/41467_2024_52324_Fig7_HTML.png
a用载体治疗3LL-ΔNRAS肿瘤7天后的肿瘤体积变化 (n = 5)，100 mg/kg RMC-4998 (n = 7)，30 mg/kg RMC-4550 (n = 8) 或组合 (n = 8)。每个条代表一个肿瘤。使用Welch的单向ANOVA进行分析。b每天用载体治疗的3LL-ΔNRAS原位肺肿瘤小鼠的存活率 (n = 6)，RMC-4550 (n = 8)，RMC-4998 (n = 8)，RMC-4550 + αPD-1 (n = 8)，RMC-4998 + αPD-1 (n = 8)，RMC-4998 + RMC-4550 (n = 13)，RMC-4998 + RMC-4550 + αPD-1 (n = 15)。使用对数秩Mantel-Cox检验进行分析。c小鼠肿瘤体积变化 (b) 治疗3LL-ΔNRAS肿瘤4周后。每个条代表一个肿瘤。使用双尾mann-whitney检验计算统计学。d用三重组合治疗7天的3LL-ΔNRAS肿瘤中显着 (fdr < 0.05) 下调或上调途径的总结 (n = 4只小鼠，2个个体肿瘤/小鼠) 或双联体组合 (n = 4只小鼠，2个个体肿瘤/小鼠) (MSigDB标志)。e治疗7天的3LL-ΔNRAS原位肺肿瘤的qPCR分析。数据为平均值 ± SD；n = 4只小鼠/组。每个点代表一个肿瘤，2个肿瘤/小鼠。使用单向ANOVA计算分析。fCD8的频率+和CD4+T细胞和Ki-67频率+CD8+和CD4+用载体治疗2周后，3LL-ΔNRAS肿瘤中的T细胞 (n = 5)，RMC-4998 + RMC-4550 (n = 9) 或RMC-4998 + RMC-4550 + anti-PD-1 (n = 12)。数据为平均值 ± SD。每个点代表一个独立的生物小鼠，其中分离的肿瘤汇集在一起。使用单向ANOVA计算分析。g每天用RMC-4998和RMC-4550联合治疗的3LL-ΔNRAS原位肺肿瘤小鼠的存活率 (n = 11) 在存在或不存在10 mg/kg anti-CTLA-4的情况下 (n = 12) 和10 mg/kg anti-PD-1 (n = 12) (每周两次，持续2周)。CRs，其中在治疗停药后1个月通过微ct扫描未检测到肿瘤。h小鼠肿瘤体积变化 (g) 用RMC-4998和RMC-4550联合治疗4周后 (n = 10) 在存在或不存在anti-CTLA-4的情况下 (n = 12) 和anti-PD-1 (n = 12)。每个条代表一个肿瘤。使用Welch的单向ANOVA进行分析。对于所有统计分析 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。源数据和精确p值作为源数据文件提供。
全尺寸图像
尽管用RMC-4998或RMC-4550单一疗法治疗肿瘤可延长生存期并增强TME的发炎表型，但单独添加anti-PD-1并不能改善生存反应。相比之下，靶向治疗使肿瘤对anti-PD-1敏感，从而显着延长了生存期，这与我们先前在皮下肿瘤中的观察结果一致 (图4c,7b和补充图。4b)。治疗4周后的微ct扫描显示，anti-PD-1与双重靶向治疗的结合更有效地抑制了肿瘤并阻止了它们的生长 (图。 7c)。此外，rna-seq的7天治疗的肿瘤表明IFN和炎症相关途径的RMC-4998联合治疗的肿瘤富集，与双靶向治疗相比，RMC-4550和anti-PD-1 (图。 7d)。与这些数据一致，经治疗的肿瘤的qPCR表明参与IFN途径和细胞毒性反应的基因表达显着增加 (Ifng,Gzmb,Prf1无花果。 7e)。此外，用三联组合治疗2周的肿瘤的特征是CD8浸润增加。+和CD4+T细胞 (图。 7f)。这些数据支持RMC-4998和RMC-4550的组合可以通过增强的IFN途径诱导和T细胞持久性使免疫排斥的肿瘤对anti-PD-1免疫疗法敏感的想法。然而，与皮下肿瘤相比，三重组合在原位肺环境中仍然不能产生完全的反应。为了扩展我们的发现，我们决定评估RMC-4998和RMC-4550的组合是否可以使肿瘤对其他免疫疗法敏感并产生完全反应。因此，我们采用anti-CTLA-4抗体来减弱cd28对阳性共刺激的CTLA-4抑制。与RMC-4998和RMC-4550相结合，与双靶向治疗相比，anti-CTLA-4延长了生存期，并产生了一只无肿瘤小鼠 (图。 7克)，其中3/12只小鼠表现出肠道炎症，而四重组合在治疗4周后对肿瘤消退的影响最强 (图。 7小时) 导致两只无肿瘤小鼠 (图。 7克)。用四联组合治疗7天的3LL-ΔNRAS肿瘤的免疫表型显示CD8的浸润和活化增加+和CD4+T细胞 (补充图。7b, c)。一些研究表明，组织肿瘤部位影响抗肿瘤T细胞介导的反应，肺和引流淋巴结的T细胞被不同地调节到皮下设置，这可以解释两种设置之间观察到的反应差异34,39。考虑到这些观察结果和肺肿瘤负荷的小鼠具有多于一个肿瘤病变，我们仍然设法在这种侵袭性肺癌模型中使用这些组合在肺环境中产生CRs。这些数据证明了在免疫排除的ICB抗性NSCLC模型中组合RMC-4998和RMC-4550以增强肿瘤消退和延长存活的潜力。平行地，该组合可以进一步与免疫疗法组合以通过增强IFN应答和抗肿瘤免疫来产生长期应答。
讨论在用adagrasib和sotorasib治疗的患者中观察到的短期反应，其针对KRAS的非活性构象G12C,强调需要开发可以防止耐药性出现和延长反应的疗法8,9。在这项研究中，我们使用了RMC-4998，一种靶向KRAS活性，GTP结合形式的化合物G12C,并显示出比adagrasib更快、更有效的活性。这可以归因于adagrasib和其他靶向GDP结合KRAS的抑制剂的局限性G12C,这取决于KRAS的内在GTPase水解速率G12C将KRAS转换为非活动状态。然而，虽然使用活动状态RASG12C以临床前工具化合物RMC-4998为例的抑制剂应防止某些耐药机制，例如活性KRAS的增加。G12C游泳池20,目前的临床前数据表明，仍然可以观察到可能由野生型RAS同工型的反馈激活引起的适应性抗性和MAPK再激活。14。在这里，我们显示使用RMC-4550同时抑制SHP2抑制MAPK再激活，增强凋亡诱导并维持IFN通路激活。鉴于致癌KRAS在驱动免疫抑制中的作用，预防MAPK再激活对于阻断癌细胞固有的适应性抗性和维持免疫抑制性TME以及交叉抗性的潜力至关重要40。最近的研究证明了IFN途径在癌症中的矛盾作用。我们以前已经证明，癌细胞内在IFN反应的激活对于诱导适应性细胞毒性抗肿瘤免疫程序和KRAS诱导的长期反应至关重要。G12C抑制，特别是与anti-PD-1疗法联合使用24。在这里，使用免疫原性肺癌模型，我们还证明了适应性免疫对于抑制KRAS和/或SHP2后预防复发和产生免疫记忆至关重要。强调适应性免疫在产生长期抗肿瘤反应中的重要性。事实上，虽然加入SHP2抑制剂和RASG12C(ON) 抑制提供了生存益处，它是RAS的组合G12C(ON) anti-PD-1阻断抑制是临床前模型中肿瘤根除的主要驱动力，对ICB具有一定程度的内在敏感性，确认适应性免疫在产生持久反应中的关键作用。然而，在对KRAS敏感性降低的肿瘤中G12C抑制，例如我们生成的KPAR.M7模型，我们观察到尽管对RAS的anti-PD-1阻断敏感G12C(ON) 抑制，添加SHP2抑制剂可以进一步增强抗肿瘤免疫并导致肿瘤根除。我们以前已经表明，即使KRAS，对ICB具有抗性的肿瘤也不会从adagrasib和anti-PD-1的组合中获得任何优势。G12C抑制可以部分逆转这些模型中的免疫抑制机制24。同样，当将RAS(ON) G12C-selective抑制剂RMC-4998与3LL-ΔNRAS肿瘤中的anti-PD-1结合时，我们没有观察到生存期的延长。一种免疫排除模型，代表对ICB具有内在抗性的肺肿瘤。相比之下，在该临床前模型中，KRAS(ON) G12C-selective和SHP2抑制剂的组合显著延长存活，表明具有免疫逃避性肿瘤的患者可以从该组合获得更大的益处。然而，表明该模型的免疫抑制性质，与免疫原性KPAR相反G12C模型，两种KRAS的联合抑制G12CSHP2并没有导致肿瘤根除，只是延迟了进展，表明适应性免疫的参与不足。然而，当在这种情况下添加anti-PD-1时，它会导致一些小鼠的肿瘤根除和免疫记忆的发展，表明靶向两个KRASG12CSHP2可以使非免疫原性肿瘤对anti-PD-1疗法敏感，并实现长期反应。就对ICB的反应而言，与RAS(ON) G12C-selective和SHP2抑制剂的组合治疗似乎将免疫排斥的冷肿瘤转化为免疫发炎的热状态。一个值得注意的观察是，使用批准的KRAS的组合G12C(OFF) 抑制剂adagrasib可以对免疫排除的肿瘤具有类似的作用，表明这些组合与多种KRAS的潜在用途G12C(OFF) 目前正在临床试验中的抑制剂。此外，考虑其他RAS突变选择性抑制剂在与SHP2抑制剂和anti-PD-1阻断组合时是否具有类似的作用是有趣的。鉴于致癌KRAS和SHP2在调节癌细胞内在机制中的多效性作用，包括TME的间接调节，以及SHP2的癌细胞外在功能，KRAS的联合抑制有几种潜在的机制G12CSHP2可以使免疫逃避肿瘤对anti-PD-1疗法敏感。在癌细胞中，RAS(ON) G12C-selective和SHP2抑制剂的组合防止MAPK再激活，这延长了由致癌KRAS驱动的免疫逃避机制的逆转，如分泌免疫逃避细胞因子和抑制IFN反应。此外，该组合导致癌细胞死亡增加，这可能导致由于抗原呈递细胞的吞噬作用而导致免疫原性抗原的摄取增加。41,42。抗原呈递的增加以及持续和增加的IFN信号传导可以引发T细胞反应，从而增加对anti-PD-1/PD-L1轴的依赖性43。同时，增强肿瘤消退和预防复发可以扩大T细胞的恢复窗口44。或者，SHP2抑制对TME的癌细胞非依赖性效应也可有助于对anti-PD-1的敏感性。与我们的数据一致，已经表明SHP2抑制耗尽免疫抑制性肿瘤相关的巨噬细胞，从而使巨噬细胞的募集具有促进抗肿瘤免疫的潜力。30。我们还证明，SHP2抑制可导致巨噬细胞成熟和抗原呈递程序的诱导，而与癌细胞内在信号传导无关，这与最近的研究相吻合，这些研究表征了SHP2抑制在巨噬细胞中的作用。巨噬细胞可导致抗肿瘤免疫反应。这些包括诱导CXCL9表达，这是几种肿瘤中的强预后生物标志物，以及骨髓来源的髓样细胞的分化，这两者都可以诱导CD8+T细胞募集和激活36,45,46。SHP2癌细胞外在效应不限于髓样细胞。事实上，我们已经观察到与KRAS相比，SHP2抑制后T细胞肿瘤浸润增加。G12C抑制。这表明SHP2在T细胞增殖和/或募集方面的直接作用，与以前的报道一致47。此外，我们观察到用双重疗法治疗的肿瘤中NK细胞扩增和细胞毒性增加。Niogret等人的研究表明，SHP2对于NK细胞的IL-15R-mediated扩增和激活是必不可少的。37。在这项研究中，我们提供的证据表明SHP2抑制可以促进肿瘤浸润b细胞和浆细胞的频率增加。B细胞已被描述为在调节抗肿瘤免疫中具有关键作用，包括针对肿瘤衍生的逆转录病毒元件的抗原呈递和抗体分泌48,49。抗PD-(L)1阻断抗体，作为单一疗法或与化疗联合，构成了大多数KRAS突变型NSCLC患者的一线治疗29。然而，最近的研究也表明了其他免疫疗法的潜在益处，包括anti-CTLA-4阻断抗体50,51。在这项研究中，我们证明了RAS的组合G12C(ON) 和SHP2抑制也使免疫逃避肿瘤对anti-CTLA-4治疗敏感，导致持久的反应。有趣的是，在皮下肿瘤中，anti-CTLA-4治疗优于anti-PD-1阻断。基于对肿瘤的免疫表型分型，我们推测这种差异作用可能部分归因于anti-CTLA-4阻断CTLA-4免疫抑制特性的能力，例如通过结合CD80/86减弱CD28信号传导。35,52,53。然而，最近的研究已经确定了anti-CTLA-4治疗在激活抗肿瘤免疫反应中的新特性，例如fc γ 受体接合介导的骨髓激活。54。因此，我们不能排除anti-CTLA-4处理对TME的影响。鉴于由KRAS和SHP2的组合抑制诱导的TME内免疫细胞群体的许多变化，这提供了与其他免疫疗法组合的基本原理。已报告研究药物RMC-6291，RAS(ON) G12C-selective抑制剂的初步临床活性数据，包括晚期KRAS患者的临床活性证据G12C先前在非活动状态KRAS上进展的突变NSCLCG12C抑制剂22。要知道对新一代RAS(ON) G12C-selective抑制剂的反应持续时间与第一代KRAS相比还为时过早G12C(关闭) 抑制剂。然而，根据以前的靶向治疗经验，可能最终会产生耐药性，需要联合治疗。维持或甚至增强突变体特异性KRAS抑制剂在TME中具有的积极作用的组合是特别令人感兴趣的。在这里我们显示对于免疫逃避肿瘤，这可以通过额外靶向SHP2来实现，并且正是SHP2抑制的肿瘤细胞内在和细胞外在效应的组合使肿瘤对ICB敏感并产生持久反应。重要的是要考虑这些组合的潜在毒性。sotorasib联合anti-PD-1检查点阻断的临床试验的初步报告表明，毒性的发生率很高，特别是与免疫相关的肝毒性55,56。这些毒性的潜在机制仍不清楚，需要进一步研究。然而，与其他KRAS的紧急数据G12C(OFF) 抑制剂表明，这些作用可能反映出化合物特异性的脱靶作用，因此希望涉及后代KRAS抑制剂的组合可能具有较低的毒性。同时，应该进行分析不同治疗方案的潜力的研究，以最大限度地提高不同疗法的效果，从而降低毒性。我们对靶向RAS的联合疗法的研究G12C(ON)，临床前模型中的SHP2和免疫检查点支持临床评估，以评估其改善肺癌临床结果的潜力，从而可以解决避免不良毒性的挑战。
方法体内肿瘤研究所有研究均在英国内政部批准的项目许可证下进行，并符合机构福利指南。所有研究计划均由弗朗西斯·克里克研究所的生物研究机构批准。使用8-10周的C57BL/6J小鼠进行所有移植动物实验。小鼠的住房以12-12 ℃ 的明暗循环和无特定病原体的条件维持，每个笼子都有嵌套，并单独通风，从不超过五只小鼠。根据英国内政部指南，湿度和温度分别保持在20-24 °C和45-65%。对于皮下肿瘤注射，150，000 KPARG12C,150，000 KPAR.M7，400，000 3LL-ΔNRAS和200，000 KPB6G12C将细胞与不含geltrexldev的还原型生长因子基质 (thermofisherscientific) 1:1混合并皮下注射到一侧。每周通过卡尺测量肿瘤生长两次或三次，并使用公式0.5 × (长度 × 宽度2)。当平均肿瘤直径超过1.5cm时，对小鼠实施安乐死。使用卡尺测量直径。对于再攻击实验，在撤回治疗后至少30天具有不可检测的肿瘤的小鼠在相对侧腹皮下注射相同数量的细胞。注射相似年龄的幼稚小鼠作为对照。对于原位肿瘤，150，000 KPARG12C或106将3LL-ΔNRAS细胞在100μl磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中尾静脉注射。通过显微CT分析测量肿瘤体积。通过吸入异氟烷麻醉小鼠，并使用Quantum GX2微-CT成像系统 (PerkinElmer) 扫描。如前所述，使用Analyse (analyzebirect) 重建连续的肺图像并分析肿瘤体积57。基于肿瘤负荷将小鼠随机分组，因为肺包含小鼠之间具有不同数量和大小的多个肿瘤。定期对小鼠进行称重和监测，并在达到从基线体重减轻15% 的人道终点或观察到任何困扰迹象时对其实施安乐死 (即弯腰，竖毛，呼吸困难)。此外，如果通过micro-ct扫描评估时，观察到小鼠的肿瘤负荷超过肺容量的70%，他们被认为有健康迅速恶化的风险，并立即实施安乐死。将小鼠随机分组，一旦肿瘤达到50-150mm的平均体积就开始治疗。3用于皮下研究，或通过原位实验的微CT可检测。每天通过口服管饲法用100mg/kg RMC-4998和/或30mg/kg RMC-4550或100mg/kgmrtx849处理小鼠。RMC-4998由Revolution Medicines，inc.根据合作研究协议提供。RMC-4550由Revolution Medicines，inc.根据与赛诺菲的前合作协议提供。使用由50 °mm柠檬酸钠缓冲液ph4中的10% DMSO/20% peg400/10% kolliphorhs15制成的制剂制备化合物。MRTX849 (MedChemExpress) 在用50 °mm柠檬酸盐缓冲液ph5.0稀释的10% captisol中制备。对于ICB治疗，给小鼠施用10 μ mg/kg anti-PD-1 (克隆RMP1-14，cat.BE0146，BioXcell) 和/或5 °mg/kg anti-CTLA-4 (克隆9H10，cat。BE0131，BioXcell) 或相应的IgG对照 (分别为大鼠IgG2a和多克隆叙利亚仓鼠IgG)。将抗体溶解在PBS中并通过腹膜内注射 (4 μ l/g) 每周两次施用2周。对于3LL-ΔNRAS原位实验，用10 μ mg/kg anti-PD-1 (克隆RMP1-14，cat. mpd1-mab15，InvivoGen) 或10 μ mg/kg anti-CTLA-4 (克隆9D9，猫。mctla4-mab10，InvivoGen) 或相应的IgG对照 (分别为鼠IgG1e3和鼠IgG2a)。抗体每周施用两次，最多4周。性别作为生物变量The KPARG12C细胞系由雌性小鼠产生，而3LL-ΔNRAS细胞系来源于雄性小鼠。我们的研究检查了靶向治疗产生的抗肿瘤免疫反应，并避免引入错误，由于诱导雌性小鼠对Y染色体中发现的基因的免疫反应，我们使用与细胞系来源的小鼠性别相同的小鼠，即移植3LL-ΔNRAS细胞的雄性小鼠和移植KPAR的雌性小鼠G12C细胞。因此，我们的研究检查了雄性和雌性动物，但在不同的环境中，因此尚不清楚具体发现是否与异性有关。细胞系和治疗NCI-H23和Calu-1是从弗朗西斯·克里克研究所获得的。如前所述产生3LL-ΔNRAS细胞58。KPAR1.3 G12C细胞 (此处为KPARG12C) 和KPB6G12C如前所述生成26。NCI-H23细胞在RPMI中生长，其余细胞在DMEM中生长。培养基补充了10% 胎牛血清，4毫米L-谷氨酰胺，青霉素 (100 μ u/ml) 和链霉素 (100 μ mg/ml)。常规测试细胞系的支原体，并通过Francis Crick Institute细胞服务设施的短串联重复DNA图谱进行鉴定。将细胞以适当的密度铺板，并在处理前使其生长至少24 °h。MRTX849获自MedChemExpress。重组小鼠ifn γ 获自Biolegend。KPAR.M7源自原位KPARG12C肿瘤用50 μ mg/kg MRTX849治疗，每周5天，持续6周。收集通过微ct扫描检测到的在治疗过程中生长的肿瘤，并将其解离成小块放入培养皿中以产生细胞系，将其在补充有GlutaMAX的DMEM-F12培养基的培养物中进一步传代®,10% FBS，1 µ m氢化可的松，20 ng/ml mEGF，50 ng/ml mIGF，青霉素 (100 U/ml) 和链霉素 (100 mg/ml) 和50 nm的MRTX849，在三代后从培养基中除去。将细胞系单一分选到96孔板中，并扩增单克隆以产生KPAR.M7细胞系 (尚未鉴定)。细胞活力和凋亡测定对于活力测定，使细胞在96孔板中生长，并在24小时后加入抑制剂。72 °C后，加入5 °l的celltiter-blue (Promega)，并将细胞在37 °C下孵育90 °C，然后使用EnVision读板器 (PerkinElmer) 测量荧光。对于长期增殖测定，将细胞接种在24孔板中并处理6天。治疗3天后替换化合物。在处理结束时，将细胞固定并使用在2% 乙醇中的0.2% 结晶紫染色。使用流式细胞术测量凋亡细胞的百分比。将细胞接种在6孔板中并处理72 °h。在处理结束时，将收获的细胞重悬于膜联蛋白V结合缓冲液中，并用FITC膜联蛋白V (bdbiosciences) 和DAPI染色。蛋白质印迹法将细胞接种在6孔板中并在24小时后处理。在处理结束时，使用补充有完全Mini蛋白酶抑制剂混合物和PhosSTOP磷酸酶抑制剂 (Roche) 的10X细胞裂解缓冲液 (细胞信号传导) 裂解细胞。使用BCA蛋白质测定试剂盒 (Pierce) 定量后，在4-12% NuPAGE bis-tris凝胶 (lifetchnologies) 上分离蛋白质 (15-20 μ g) 然后转移到PVDF膜上。将结合的第一抗体与HRP缀合的第二抗体 (Amersham) 一起孵育，并使用化学发光 (luminatahrp底物，Millipore) 进行检测。使用的抗体列表和扫描的印迹可以在补充信息中找到，补充表 2。定量rt-pcr按照制造商的说明，使用rneasymini试剂盒 (Qiagen) 从细胞系或冷冻的肺肿瘤中提取RNA。对于体内肿瘤样品，使用不含RNase的一次性颗粒杵 (Kimble Chase)，然后使用QIAshredder柱 (Qiagen) 将从肺中单独分离的肿瘤裂解并均质化。使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒 (thermofisherscientific) 产生cDNA，并使用fastsybrgreenmastermix (应用生物系统公司) 进行qPCR。使用的底漆清单详见补充信息补充表 4。使用 Δ Δ ct方法计算相对于管家基因的基因表达变化。RNA测序如上所述提取RNA。使用TapeStation 4000 (Agilent) 测量RNA质量。根据制造商的说明，使用NEBNext ultraii定向polyasmrna (新英格兰生物实验室) 制备文库，输入150 °c和10个PCR循环用于文库扩增。使用TapeStation 4200 (Agilent) 测量文库质量。在illuminarovaseq 6000系统中，将样品测序至〜25m的深度配对末端100 °bp读数。对于数据分析，使用具有STAR和RSEM的nfcore/rnaseq管道对测序读数进行预处理并映射到小鼠GRCm38基因组。使用R软件包DESeq2进行治疗组之间的差异分析。使用R包fgsea进行基因集富集分析，使用由DESeq2计算的Wald统计值的排序列表进行每次比较。使用R包msigdbr从MSigDB处可用的标志集合中获取基因。光谱和常规流式细胞术使用方案1方法对小鼠实施安乐死，分离肺肿瘤，并将来自一个肺的所有肿瘤合并在一起。将肿瘤细切成小块，并用胶原酶 (1 μ mg/ml; Thermofisherscientific) 和DNase I (50 μ u/ml; Life Technologies) 消化在HBSS中在37 °C下持续45 °C。通过70 μ m过滤器 (Falcon) 过滤样品，并使用ACK缓冲液 (liftechnologies) 裂解红细胞。对于常规流式细胞术，在PBS中洗涤后，将细胞用可固定活力染料etfluor870 (BD水平) 染色30分钟，并用CD16/32抗体 (BioLegend) 封闭10分钟。使用荧光标记的抗体混合物对样品进行表面标记染色，然后在FACS缓冲液 (2 °mmedta和0.5% 牛血清白蛋白的PBS溶液，ph7.2) 中洗涤三次。对于光谱流式细胞术，将细胞用CD16/32抗体 (BioLegend) 在4 °C封闭5分钟，然后在室温下与可固定的僵尸NIR (Biolegend) 活力染料一起染色。染色后，将样品固定在Fix/裂解溶液 (eBioscience) 中。如果进行细胞内染色，则在用细胞内抗体染色之前，根据制造商的说明书将细胞固定并用Foxp3/转录因子固定/透化试剂盒 (Invitrogen) 透化。用常规的脾或单染eBeads (Invitrogen) 和用于光谱流式细胞术的ultracompebeads (Invitrogen) 进行单染对照。使用的抗体清单详见补充信息、补充表格 1和3。将样品重悬于FACS缓冲液中，并使用用于常规的FACSymphony细胞仪 (BD) 和用于光谱流式细胞术的5L光谱分析仪Aurora (Cytek) 进行分析。使用FlowJo软件分析数据，门控策略详见补充图。 8用于常规和补充图。 9用于光谱流式细胞术。对于NK和T细胞的细胞内染色，将细胞悬浮液在补充有1:1000 BD GolgiPlug (BD Biosciences)，1 μ g/ml离子霉素的RPMI中孵育，50 °ng/mlpma (所有Sigma) 分别持续1和4 °h，然后使用Foxp3/转录因子固定/透化试剂盒 (Invitrogen) 进行染色。多重免疫荧光将样品在10% NBF中固定24 °c，然后转移至70% EtOH。使用tisse-tek VIP对样品进行石蜡包埋®6个AI处理器。切割3微米的FFPE切片并在60 °C下烘烤1 °C，然后在bondrxleicabond Rx平台上进行染色。过氧化氢 (3%) 用于封闭内源性过氧化物酶，0.1% BSA溶液用于蛋白质封闭。用表位修复溶液1或表位修复溶液2进行每种抗体之间的抗原修复剥离步骤20分钟。进行三重IF染色，并将抗体与蛋白石一起应用™按以下顺序配对: FoxP3 (CST，12653) 1:400与蛋白石570 1:500，CD8 (Abcam，ab217344) 1:500与蛋白石690 1:200和CD4 (Abcam，ab183685) 1:750与蛋白石520 1:500。结合抗兔聚合物 (Leica，novolinkmax聚合物，RE7260-CE) 用作所有抗体的第二抗体。载玻片用DAPI (thermoscientific，62248) 1:2500复染。用延长金抗褪色试剂 (Invitrogen，P36934) 安装载玻片，并使用PhenoImager HT (以前称为Vectra Polaris) 使用MOTiF扫描模式进行扫描。对于8重免疫荧光抗体与蛋白石一起应用™按以下顺序配对: arginase-1 (CST，93668) 1:500与蛋白石690 1:150，PD-1 (Abcam，ab214421) 1:500与蛋白石620 1:200，b220 (BD Biosciences，553086) 1:750配蛋白石520 1:300，CD4 (Abcam，ab183685) 1:750配蛋白石480 1:150，Ki67 (Abcam，ab15580) 1:2500含蛋白石570 1:300，cCasp3 (CST，9579s) 1:500含蛋白石650 1:700，CD8 (Abcam，ab217344) 1:500与tsa-dig 1:100，然后是anti-dig-Opal 780 1:25。结合抗兔聚合物 (Leica，RE7260-CE) 用作在兔中产生的抗体的二级抗体。链霉亲和素-过氧化物酶 (Dako，P0397) 1:500用于在大鼠中产生的生物素化抗体。载玻片用DAPI (thermoscientific，62248) 1:2500复染。用延长金抗褪色试剂 (Invitrogen，P36934) 安装载玻片，并使用PhenoImager HT (以前称为Vectra Polaris) 使用场扫描模式进行扫描。产生了组织特异性光谱库，并使用Phenochart进行了光谱分解和自体荧光去除™并告知®软件。使用QuPath 0.5.0x64进行分割和蛋白质分析。统计分析使用Prism 8 (GraphPad软件) 分析数据，使用正态分布检验、Mantel-Cox、双尾Student'st-测试，单向，双向或韦尔奇的方差分析，如所示。显著性确定于p < 0.05 (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001)。报告摘要有关研究设计的更多信息，请参阅 Nature投资组合报告摘要链接到这篇文章。
数据可用性Rna-seq数据已保存在Gene Expression Omnibus数据库中，登录号为GSE254755。其余数据可在文章、补充信息或源数据文件中找到。 源数据是本文提供的。
研发企业：加科思药业
药物代号：JAB-3312（SHP2抑制剂）
https://oss.yuaigongwu.com/pic/20250416/1744738064283964693.jpg
页:
[1]